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Sulfo-Cyanine3 NHS Ester是Cyanine3的水溶性、胺反应活化酯，能够在纯水溶性环境或无任何有机溶剂反应体内进行蛋白和多肽的有效标记。非常适合具极低水溶性和易变性蛋白的标记。


分子式：C35H40N3KO10S2
分子量：765.95g/mol
纯度：≥95%
外观：红色至深红色结晶粉末或固体
溶解性：溶于水，DMF，DMSO
Ex/Em：~548/562nm
摩尔吸光系数：150000L·mol^-1·cm^-1
A280/Amax：8%
光谱相似染料：Alexa Fluor 555,DyLight 555
结构式：
    
保存：-20℃避光干燥，有效期2年。

• Sulfo-Cyanine3 NHS Ester水溶液的稳定性很弱，建议现配现用。Sulfo-Cyanine3 NHS Ester DMSO溶液的稳定性相对高，建议置于-20℃避光保存，2周稳定。
  
• Sulfo-Cyanine3 NHS Ester具水溶性，除非标记实验严格要求纯水溶性环境，建议用DMSO溶解配制成母液后使用。一般情况下，Cy系列染料在含有机溶剂体系内的标记效率相对高些。
  
• Cy染料和生物分子的比例（F/P）=4～12之间荧光强度最高。F/P过高，荧光探针会自我淬灭并且影响生物分子的活性。CyDye NHS在pH8.5～9.4内标记抗体10min，F/P可达5~6。但在pH7.0内几乎无反应。我司内部使用Cy3 NHS标记Anti-GST抗体发现按1:1，1:5，1:10，和1:20标记得到的F/P分别为0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。

一、水溶性Cy3 NHS标记Anti-GST抗体
其它Cyanine Dye NHS参考此方法进行并做适当摸索。

• 商业化购买的抗体如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明胶等），或溶于带氨基的缓冲液，会影响标记。需在标记前对抗体进行纯化。
  
• 于1L 0.15M NaCl溶液中透析Anti-GST（0.5mL，3mg/ml），室温或4℃透析4h。
  
• 换用1L新鲜的0.15M NaCl溶液，4℃透析过夜。
  
• 第二天再换用1L 0.1M NaHCO3（pH8.3），4℃透析4h。
  
• 【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。
  
• 用0.1M NaHCO3（pH8.3）稀释少量的抗体，于280nm测其紫外吸收值并计算标记抗体的总量（IgG抗体摩尔吸光系数为170,000 at 280nm）。
  
• 用DMSO配制Cy3 NHS（Mw:765.95），浓度为10mg/ml。根据CyDye NHS和抗体的使用比值（比如1:20）来计算所需要染料的体积。然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时于暗处低速搅拌，室温45min。
  
• 用1L 0.15M NaCl溶液，常温或4℃避光透析4h，以除去未标记上的Cy3 NHS。
  
• 换用新鲜的1L 0.15M NaCl溶液，4℃避光透析过夜。
  
• 换用1L 0.01M PBS/0.01% NaN3溶液室温或4℃避光透析4h，然后在4℃避光再次透析过夜。
  
• 【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。
  
• 用0.01M PBS/0.01% NaN3溶液整数倍稀释标记抗体，测定280nm（蛋白）和552nm（Cy3）处的紫外可见吸光度。
  
• 产品冷冻干燥成粉末或置于0.01M PBS/0.01% NaN3溶液中，-20℃避光保存。
  
• F/P计算：
  Cy3在552nm下的摩尔吸光系数为150,000L·mol^-1·cm^-1，此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000L·mol^-1·cm^-1，不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy3本身在280nm处的吸收是552nm处的8%。按照以下公式计算F/P值。
  [Cy3] = A₅₅₂/150000;
  [Antibody] =[A₂₈₀-(0.08×A₅₅₂)]/170000
  F/P_final =[Cy3]/[Antibody]= [1.13×A₅₅₂]/[A₂₈₀-(0.08×A₅₅₂)]

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